研究技術背景

進化分子工学

当社は埼玉大学発スタートアップとして2016年8月に設立されました。1985年頃から埼玉大学では、伏見譲 博士らによって進化分子工学(Evolutionary Molecular Engineering)の研究が進められてきました。それと同時期、George P. Smith 博士( 2018年度ノーベル化学賞)は、 「ペプチドと抗体のファージディスプレイ法」の研究を始めていました。ファージディスプレイ法の無細胞翻訳系版である”in vitro virus (mRNAディスプレイ)”法は、伏見博士、当社代表取締役根本らによって世界に先駆けて開発された歴史があります。mRNAディスプレイ法はファージディスプレイ法の約1万倍の効率を持つが、安定性の面で難がありました。そこで、新たにcDNAディスプレイ法の開発が行われ、質・量(=配列多様性)ともにファージディスプレイ法を超える特徴を持つ遺伝子型-表現型分子対応付け技術となりました。

核酸(DNA/RNA)やタンパク質といった生体高分子は、40億年にもわたる生物進化の過程で高度な機能を獲得してきました。現在では、実験者の意図する塩基配列を有するDNA/RNAの化学合成、またはアミノ酸配列を有するペプチドやタンパク質の合成が可能となっています。しかしながら、実験者の意図する機能を有する核酸やタンパク質の配列を一からデザインすること、つまり構造論的なアプローチでの分子デザインは未だに困難となっています。進化分子工学とは、実験室内で分子進化を高速に行うことで、目的の機能を有する新規機能性高分子を獲得する進化論的なアプローチのことを言います。

当社では、進化分子工学技術の一つであるcDNAディスプレイ法により、標的分子に対して特異的で高親和性(nMからそれ以下のオーダーのKD値)な結合能を示すVHH抗体や、環状ペプチドを当社独自の試験管内ハイスループットスクリーニングプラットフォームをを利用して獲得し、それらの医薬品応用研究開発等を行っています。

バイオ医薬品開発におけるパラダイムシフト:シングルドメイン抗体(VHH)の台頭

バイオ医薬品開発におけるパラダイムシフト:シングルドメイン抗体(VHH)の台頭

1980年代より、バイオテクノロジーを応用した遺伝子組換えタンパク質のインスリンやエリスロポエチンなどが医薬品として開発されました。その後、1987年に最初のヒト化抗体技術が発表されると、次世代バイオ医薬として抗体創薬が脚光を浴びました。1990年代からのゲノム創薬の進展とともに多くの標的分子に対する抗体の研究開発が進められ、2018年には抗体医薬品はバイオ医薬品市場の62%を占めるまで成長しました。今後も抗体医薬は革新的な技術やコンセプトに基づいて次世代抗体の登場も期待される一方で、抗体医薬品の限界も顕在化してきました。

一方、VHHは1993年にベルギーのブリュッセル自由大学のHamers教授によって発見されました(Hamers-Casterman, C., et al. Nature 363, 446-448 (1993))。創薬に有利な多くの特徴を有しているものの、抗体医薬品が次世代バイオ医薬品として注目を集め始めた時期と重なり、大企業から注目されることはありませんでした。しかし、ベルギーでVHHの医薬品化を目指すバイオベンチャー企業が立ち上がり、低分子化抗体医品の一つとして研究開発がすすめられました。そして、VHH抗体医薬の第1号として、2018年FDAは後天性血栓性血小板減少性紫斑病(aTTP)を適応に抗von-Willebrand因子に対するVHHを承認しました。現在、多くの創薬企業は従来の抗体医薬品からVHHへの転換に取り組んでいます。

世界のVHH創薬開発パイプライン

グローバルではVHHをベースとしたバイオ製剤が臨床開発中です。下表は代表的な品目です。(当社調べ)

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VHH製剤名称 標的分子 適応症 ステータス
Caplacizumab Von Willebrand因子 後天性血栓性血小板減少性紫斑症(TTP) 上市
2018: EMA承認
2019: FDA承認
Ozorlalizumab TNF-a 関節リウマチ 第Ⅱ相
Vobarilizumab IL-6受容体 関節リウマチ
全身性エリテマトーデス(SLE)
第Ⅱ相
第Ⅱ相
ALX-0171 RSウイルス 下気道感染症 第Ⅱ相
ALX-0761
/MSB0010841
IL-17A, IL-17F,
IL-17A/F
乾癬 第Ⅱ相
CAR-T CD19/CD20 治療抵抗性B細胞性リンパ腫 第Ⅰ相
M6495 ADAMTS-5 変形性関節症 第Ⅰ相
203027 ロタウイルス 下痢 第Ⅱ相
68-GaNOTA
Her2 VHH
Her2 乳癌の脳転移 第Ⅱ相

出典: http://tabs.craic.com

VHHとは?

アルパカ(Vicugna pacos)やリャマ(Lama glama)などのラクダ科動物の血液中には、2つの重鎖(H鎖)と軽鎖(L鎖)で構成されるIgG抗体 (A)の他に、約20~40%の割合で重鎖のみで構成される抗体(重鎖抗体; HCAb)(B)が存在することが報告されています。重鎖抗体では軽鎖とのヘテロダイマーを形成しないため、重鎖定常領域のCH1ドメインが欠失しています。IgG抗体におけるVHーVL間の疎水性相互作用が無いために、通常は分子内に埋もれているアミノ酸残基が表面に露出しており、幾つかのポジションにおいて親水的なアミノ酸(ホールマークと呼ばれる)への置換が観察されます。重鎖抗体の可変領域がVHH (C)、またはシングルドメイン抗体と呼ばれています。その分子量は12-15 kDaで、IgG抗体(約150 kDa)、Fab 断片(約50 kDa)、一本鎖抗体scFv(約25 kDa)と比較して小さく、抗体工学技術を応用した医薬品への応用が期待されます。

VHHとは?

IgG抗体 (A)、重鎖抗体 (B)、VHH (C) の比較

VHHは、それ自体で従来のIgG抗体と同様に高い抗原特異性と親和性を有します。IgG抗体はVHおよびVLそれぞれの3つの相補性決定領域(CDR)によって抗原結合部位を形成しますが、VHHは3つのCDRのみで(下図黄色部分)で抗原を認識します。特にCDR3は抗原結合に重要な領域で、ペプチドアプタマー様の結合によって、標的分子の隙間、割れ目、くぼみといった従来の抗体では結合できない部位を認識できます。

VHHとは?その2

VHHの立体構造

VHHは従来抗体とは異なる部位する(構構造)を好んで結合する

VHHのCDRが形成する抗原結合部位(パラトープ)の構造は、従来の抗体(IgG抗体)のそれより遥かに多様性に富むことがわかっています。
従来の抗体は抗原の凸部に結合します。一方、VHHは窪みや隙間(割れ目)を好んで認識しますが、凸面にもまた平面に近い構造にも結合し、低分子をも認識できるとの報告がされています。

VHHは従来抗体とは異なる部位する(構構造)を好んで結合する

参考文献
Structure and development of single domain antibodies as modules for therapeutics and diagnostics. Hoey R.J., Eom H., Horn J.R., Experimental Biology and Medicine, 244, 1568-1576 (2019)

VHH CDR3の特徴

VHHのCDR3アミノ酸残基数の特徴

上記グラフは、現在報告されているデータベース上の約400種類のVHHに関して、CDR3の分布とそのクローン数の相関を示したものです。標的分子(= 抗原)結合性VHHにはCDR3のアミノ酸残基数には優位性があることが特徴的です。また同時に、VHHもCDRのアミノ酸配列に相関した特定の構造を形成する傾向があることが示唆されています。

環状ペプチド/ペプチドアプタマー

当社では、ペプチド鎖内の一組のシステイン残基間で架橋剤を用いた環状構造を形成し、その間の領域に様々な鎖長のランダムなアミノ酸配列を有する環状ペプチド(cPep)ライブラリを用意しています。その詳細はコアテクノロジー欄にも記載しております。

進化分子工学技術の一手法であるファージディスプレイ法やmRNAディスプレイ法(共に後述)を利用した環状ペプチドのスクリーニング試験に関する報告がされています。特にmRNAディスプレイ法を利用した場合には、遺伝子リプログラミングにて導入された非天然アミノ酸を用いてペプチドを自発的に環状化させます。一方で当社の場合は、2つのシステイン残基間のジスルフィド結合、または化学架橋剤を用いてペプチドを環状化させる点で異なります。当社では、作製するcDNAディスプレイライブラリの形成効率をはじめ、様々な条件を検討・鑑みて上記の環状化方法を採用しています。

Macrocyclic peptide-based inhibition and imaging of hepatocyte growth factor, Sakai K., et al., Nat Chem Biol., 6, 598-606 (2019) Reprogramming the Translation Initiation for the Synthesis of Physiologically Stable Cyclic Peptides, Goto Y., et al., ACS Chem. Biol., 3, 120-129 (2008)
Ribosomal Synthesis of Bicyclic Peptides via Two Orthogonal Inter-Side-Chain Reactions, Sako Y., et al., JACS, 130, 7232-7234 (2008)